中性鞘糖脂是一种重要的两亲性脂质分子，其在细胞膜运输和信号传导过程中发挥作用。此外，中性鞘糖脂分子水平上的变化与多种神经疾病、代谢紊乱和癌症相关。由于鞘糖脂丰度低、离子化效率低、结构复杂，已有的分析方法对中性鞘糖脂组的鉴定覆盖率一般低于20%。近期清华大学化学系瑕瑜课题组开发了一种选择性富集结合多层级结构分析的策略，实现了脑组织中浓度跨越4个数量级，超过300个中性鞘糖脂分子的深度结构分析，远超已有的文献报道。此方法进一步揭示了胶质瘤组织中鞘糖脂代谢异常，并实现IDH突变型、野生型胶质瘤组织及正常脑组织的准确分型。相关工作“Illuminating the dark space of neutral glycosphingolipidome by selective enrichment and profiling at multi-structural levels” 发表在《Nature Communications》上。该文的第一作者是清华大学化学系2020级博士生王紫丹，合作者为清华大学精密仪器系博士生张东晖、吴俊函及张文鹏助理教授，通讯作者为瑕瑜教授。该课题得到了国家自然科学基金（No. 22225404 和 22227807）以及国家重点研发计划（2018YFA0800903 和 2022YFC2406701）的支持。感谢复旦大学华山医院的花玮教授提供人脑组织样本。
图1. a.鞘糖脂的结构; b. 选择性富集流程; c. 利用TiO2 MNPs对猪脑极性脂质提取物的选择性富集。
鞘糖脂的结构包括中性糖环头基、鞘氨醇和酰基链三部分(图1a)。鞘糖脂的结构多样性来源于其合成过程中多种酶的参与，其中包括鞘糖脂中糖环个数以及糖环修饰的变化，鞘氨醇和酰基链的链长、不饱和度、羟基位置和双键位置等精细结构的变化。鞘糖脂的糖环结构在广泛的pH（1.5-14）范围内能够与TiO2中的Ti(IV)活性位点稳定配位，而磷脂中的磷酸官能团仅在中性到弱酸性环境下与Ti(IV)配位(图1b)。据此，作者设计了一套鞘糖脂的选择性富集流程。 使用该方法，猪脑极性脂质中99%的磷脂可被去除 (图1c)，鞘糖脂回收率高于75%，最终实现30倍富集效率。
作者进一步采用2-乙酰吡啶作为带电荷标签的PB试剂，对鞘糖脂的双键结构进行衍生。除了提高分析灵敏度，PB-MS/MS可实现鞘糖脂中双键位置和2-OH修饰的同步鉴定以及双键位置异构体的相对含量(图2)。
图2. PB-MS/MS鉴定鞘糖脂的双键位置和-OH位置
整合以上分析流程，作者绘制了猪脑中性鞘糖脂的结构图谱(图3)，涵盖头基、脂链总组成、鞘氨醇结构、酰基链结构、双键和羟基位置的5个结构层级。数据揭示了多种未被报道的中性鞘糖脂，包括多不饱和鞘糖脂（2-5 个不饱和度）、含奇数鞘氨醇/酰基链的鞘糖脂（C17, C19）、超长链(C30, C28)和短链(C16)结构的鞘糖脂、及双键结构位置异构体（n-7, n-8, n-9, n-10）。
图3. 猪脑中的中性鞘糖脂结构图谱
鞘糖脂在神经系统中显著富集，参与构成髓鞘结构，保护神经元以维持信号传导。胶质瘤占恶性脑部肿瘤发病率的80%，包括IDH基因突变型和野生型。野生型胶质瘤通常为恶性胶质母细胞瘤，且未发现有效的分子疾病标志物。作者展开了鞘糖脂在胶质瘤组织中的多层级结构定性定量分析，包括6例正常人脑组织、8例IDH突变型人肿瘤组织、8例IDH野生型人肿瘤组织。作者发现，鞘糖脂的总组成定量受到组织样本状态、个体性差异等多种干扰，同组样本间鞘糖脂RSD高达30%-160%（图4a）。而基于鞘糖脂异构体的相对定量则显著降低了同组样本间的差异（0.1%-69%），有效地提高了差异性脂质的发现。
图4. a. 对比22个脑组织样本中鞘糖脂相对含量及基于多结构层级的鞘糖脂异构体相对定量RSDs; b. 基于鞘糖脂结构的相对定量对三类组织样本分型：IDH突变胶质瘤组织，IDH野生型胶质瘤组织，正常脑组织.
通过使用鞘糖脂的链长、鞘氨醇的种类、2OH结构和双键位置异构体等精细结构的相对定量数据，作者成功区分了三种组织的类型（图4b），并发现了神经酰胺合成酶（CerS2）、脂肪酸二羟化酶（FA2H）在人胶质瘤组织中的显著下调。总的来说，此工作为研究中性鞘糖脂代谢及相关疾病标志物的发现提供了有效的分析方法。
本文编辑：王紫丹
本文审核：乔利鹏，瑕瑜
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50014-8
